简单讲，原理如下：引物1（正向）和引物2（反向）扩增产物为a；引物3（正向）和引物4（反向）扩增产物为b，现在欲将产物a和b融合为产物c。在设计引物时，先按照普通引物设计好，然后在引物2的5’端和引物3的5'端分别加上4-8个碱基（引物2所加的碱基应为产物b的5' 端4-8个碱基序列；引物3所加的碱基应为产物a的3' 端4-8个碱基序列）。
第一轮pcr，先分别用引物1、引物2扩增出片段a；引物3、引物4扩增出片段b。分别割胶**产物a和产物b，这样扩增出来的产物a和b会具有相同的末端。第二轮pcr，用引物1和引物4来扩增，用第一轮的两种扩增产物a和b混合稀释之后为模板，进行扩增。
因为产物a和b有相同重叠的末端，在pcr反应时，模板变性、退火、延伸，就会将a和b融合成产物c。
overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的gc含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的tm值（例如65度），而且使用的pcr循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。
另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是pcr退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。
而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。
如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用touchdown pcr试试。touchdown pcr方法在分子克隆上有介绍。
这种pcr使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。touch down pcr有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。
pcr相关**。
安全学原理总结
1.科学大致有两个方面 一是人类为满足物质生活和社会文化生活的需要，而对物质生产和精神生产及其规律进行的认识活动和认识的结果，我们称其为生产科学 二是人类为保全自己身心的需求，而对客观事物及其规律进行的认识活动和认识的结果，我们称其为安全科学。2.安全通常是指各种事物对人不产生危害 不导致危险 不造...
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