附件2细菌回复突变试验。
bacterial reverse mutation assay
1 范围。本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。
2 定义。2.1 回复突变 reverse mutation
细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
2.2 基因突变 gene mutation
在化学致突变物作用下细胞 dna 中碱基对的排列顺序发生变化。
2.3 碱基置换突变 base substitution mutation
引起 dna 链上一个或几个碱基对的置换。
碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。
转换是 dna 链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。
颠换是 dna 链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。
2.4 移码突变 frameshift mutation
引起 dna 链上增加或缺失一个或多个碱基对。
2.5 细菌回复突变试验bacterial reverse mutation assay
利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型→原养型回复突变的试验方法。
2.6 s9
经多氯联苯(pcb混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g 下离心 10min 后的肝匀浆上清液。
3 原理。鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的 s9 混合液。
4 仪器和设备。
培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度 0.1g 和 0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。
5 培养基和试剂。
5.1 0.5mmol/l 组氨酸-0.5mmol/l色氨酸-0.5mmol/l 生物素溶液。
配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在 0.068mpa 下高压灭菌 20min。贮于 4℃冰箱。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。
5.2 顶层琼脂培养基。
成分： 琼脂粉 1.2g
氯化钠 1.0g
加蒸馏水至 200ml
配制：上述成分混合后，于 0.103mpa 下高压灭菌 30min。
实验时，加入 0.5mmol/l 组氨酸-0.5mmol/l色氨酸-0.
5mmol/l 生物素溶液 20ml。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。
5.3 vogel-bonner (v-b) 培养基 e
成分：枸椽酸(c6h8o7·h2o) 100g
磷酸氢二钾(k2hpo4) 500g
磷酸氢铵钠(nanh4hpo4·4h2o) 175g
硫酸镁(mgso4·7h2o) 10g
加蒸馏水至 1000ml
配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至 1000ml。于 0.103mpa 下高压灭菌 30min。储于 4℃冰箱。
5.4 20%葡萄糖溶液。
成分：葡萄糖 200g
加蒸馏水至 1000ml
配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000ml。于0.068mpa下高压灭菌20min。储于 4℃冰箱。
5.5 底层琼脂培养基。
成分：琼脂粉 7.5g
蒸馏水 480ml
v-b 培养基 e 10ml
20%葡萄糖溶液 10ml
配制：首先将前两种成分于 0.103mpa 下高压灭菌 30min 后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。
按每皿 25ml 制备平板，冷凝固化后倒置于 37℃培养箱中 24h，备用。
5.6 营养肉汤培养基。
成分：牛肉膏 2.5g
胰胨 5.0g
磷酸氢二钾(k2hpo4) 1.0g
加蒸馏水至 500ml
配制：将上述成分混合后，于 0.103mpa 下高压灭菌 30min。储于 4℃冰箱。
5.7 盐溶液(1.65mol/l kcl+0.4mol/l mgcl2)
成分：氯化钾(kcl) 61.5g
氯化镁(mgcl2·6h2o) 40.7g
加蒸馏水至 500ml
配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103mpa 下高压灭菌 30min。储于 4℃冰箱。
5.8 0.2mol/l 磷酸盐缓冲液(ph7.4)
成分：磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o) 2.965g
磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o) 29.015g
加蒸馏水至 500ml
配制：溶解上述成分后，于 0.103mpa 下高压灭菌 30min。储于 4℃冰箱。
5.9 s9 混合液。
成分每毫升 s9 混合液。
肝 s9 100μl
盐溶液 20μl
灭菌蒸馏水 380μl
0.2mol/l 磷酸盐缓冲液 500μl
辅酶 ii(nadp) 4μmol
6-磷酸葡萄糖(g-6-p) 5μmol
配制：将辅酶 ii 和 6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分， 使肝 s9 加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。
实验结束，剩余 s9 混合液应该丢弃。
5.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂。
5.10.1 组氨酸-色氨酸-生物素平板。
成分：琼脂粉 15g
蒸馏水 934ml
(v-b)培养基 e 20ml
20%葡萄糖 20ml
灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100ml10ml
灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100ml10ml
灭菌 0.5mmol/l 生物素溶液 6ml
配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌 20%葡萄糖，v-b 培养基、组氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水改为944ml）。待溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。
5.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板。
成分：琼脂粉 15g
蒸馏水 930ml
v-b)盐溶液 20ml
20%葡萄糖 20ml
灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100ml） 10ml
灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100ml10ml
灭菌 0.5mmol/l 生物素溶液 6ml
氨苄青霉素溶液(8mg/ml 于 0.02mol/lnaoh 中) 3.15ml
四环素溶液(8mg/ml 于 0.02mol/l hcl 中) 0.25ml
配制：琼脂和水高压灭菌 20min，将无菌的葡萄糖、vb 盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中，混匀（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水改为加940ml）。冷却至大约 50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。
应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。
5.10.3 营养琼脂平板。
成分：琼脂粉 7.5g
营养肉汤培养基 500ml
配制：于 0.103mpa 下高压灭菌 30min 后倾注平板。
6 试验菌株及其生物学特性鉴定。
6.1 试验菌株。
采用以下菌株作为标准组合：
鼠伤寒沙门氏菌ta1535；
鼠伤寒沙门氏菌ta97或ta97a或ta1537；
鼠伤寒沙门氏菌ta98；
鼠伤寒沙门氏菌ta100；
鼠伤寒沙门氏菌ta102 或大肠杆菌wp2uvra或大肠杆菌wp2uvra（pkm101）；
6.2 生物学特性鉴定
新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表 1 所示。
表 1 试验菌株鉴定的判断标准。
6.2.1 组氨酸缺陷/色氨酸缺陷。
原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。
色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色氨酸的培养基上生长，而在缺乏色氨酸的培养基上，则不能生长。
鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线，于37℃下培养 24h 后观察结果。
结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生长，而在无色氨酸平板上则不能生长。
韩国化妆品店如何有效的建立化妆品品牌口碑
连锁项目重要的是如何在市场中能拥有良好的销售口碑，产品质量值得消费者信任，品牌被市场接受而顾客又喜欢。所以不管什么行业，关于品牌的打造都是非常重要的。对于普通的创业者，在前期从零开始创业的时候，就应该从自己擅长的领域开始，做好品牌的宣传就是让生产的产品质量得到顾客的认可。那么对于新兴成立的化妆品创业...
解析化妆品安全与消费对策
随着当下人们生活水平的提高，化妆品消费在人们日常消费中所占的比重越来越大。然而伴随着当下化妆品消费市场的巨大繁荣，化妆品的安全问题也在层出不穷。化妆品是人们日常生活的必备品，其安全与否关系着人的基本生命健康我们解析化妆品消费与安全。化妆品是多种物质的混合物，一般包括了基质原料和配合原料等等，我们说的...
母亲节化妆品策划书
母亲节活动营销方案。学号 201005020143姓名 崔节全班级 2010文秘圆母亲年轻的梦。xx化妆品母亲节期间双重馈送大奖等你拿。背景分析 随着人们的健康意识和美容护肤意识的增强，三八妇女节 母亲节等女性节日对于化妆品市场有很大拉动，也有越来越多的子女选择护肤品 美容卡作为送给母亲的礼物。一 ...